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    荧光定量PCR实验步骤及注意事项

    发布时间: 2020-04-30  点击次数: 3908次

    荧光定量pcr实验步骤

    1、总RNA抽提(*头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA酶)
    1)取匀浆器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上预冷。
    2)取100mg组织,加入到匀浆器中。
    3)充分研磨直至无可见组织块。
    4)13000g离心10min取上清。
    5)加入250 μl三氯甲烷,颠倒离心管15s,充分混匀,静置3min。
    6)4℃下13000g离心8min。
    7)将上清转移到一新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,颠倒混匀。
    8)-20℃放置15min。
    9)4℃下13000g离心10min,管底的白色沉淀即为RNA。
    10)吸除液体,加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
    11)4℃下13000g离心5min。
    12)将液体吸除干净,将离心管置于超净台上吹3min。
    13)加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。
    14)55℃孵育5min。
    2、反转录(*头和PCR均经过湿热灭菌,无RNA酶)
    1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。
    2)加入1μl oligo(dT)15。
    3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
    4)于PCR仪上70℃保温5min,迅速置冰上冷却。
    5)依次加入4μl 5×buffer,2μl 10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶,用*抽吸混匀。
    6)于PCR仪上42℃保温60min,结束后80℃保温5min灭活反转录酶。
    3、定量PCR
    1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。
    2× qPCR Mix 12.5μl
    7.5μM基因引物 2.0μl
    反转录产物 2.5μl
    ddH2O 8.0μl
    2)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。
    2×qPCR Mix 12.5μl
    7.5μM内参引物 2.0μl
    反转录产物 2.5μl
    ddH2O 8.0μl
    3)PCR扩增
    预变性 95℃,10min
    循环(40次) 95℃,15s→60℃,60s
    溶解曲线 75℃→95℃,每20s升温1℃
    4、结果处理
    ΔΔCT法:
    A=CT(目的基因,待测样本)- CT(内标基因,待测样本)
    B=CT(目的基因,对照样本)- CT(内标基因,对照样本)
    K=A-B
    表达倍数=2-K

    注意事项

    1、长度:15—30bp。
    2、G十c含量:应在40%一60%之间。
    3、碱基分布的随机性
    4、引物自身:不要含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。
    5、引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。
    6、上下游引物的互补性:一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。
    7、3’末端:如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C。
    8、设计RT-PCR的引物时,上下游引物要跨内含子,以消除基因组DNA的干扰。
    9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对,检查是否可能有错配产物扩增。
    10、引物设计要注意种属。

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