销售热线

19946275258
  • 技术文章ARTICLE

    您当前的位置:首页 > 技术文章 > Western blot常见问题摘选

    Western blot常见问题摘选

    发布时间: 2020-08-31  点击次数: 343次

    很多童鞋在做WB的时候,都会碰到一些奇奇怪怪的事情,有些事情可以解释,而有些事情,简直是诡异到摸不着头脑。下面小编给大家整理一些WB中的常见问题,大家一起探讨探讨吧。

     

    Western blot常见问题摘选(图1)

     

    1、细胞裂解液主要组分有哪些?SDS、NP-40、TritonX-100有何作用?

     

    答:细胞裂解液一般含有缓冲成分Tris,裂解成分(SDS、NP-40、TritonX-100等),以及蛋白酶抑制剂成分(PMSF等)。

    SDS、NP-40、TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。

    SDS属于离子型去垢剂,厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。

    NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉包膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

    TritonX-100的能力介于NP-40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。

     

    2、Western 及 IP细胞裂解液、RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液的用途?

     

    答:用于普通的Western 、IP或co-IP,我们推荐使用Western及IP细胞裂解液,该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用,用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后,没有非常粘滞的透明状DNA团块形成,不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化,蛋白的Western 检测。对于某些特殊蛋白的IP,如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想,可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高,即非特异的蛋白也被IP下来,则需要选用裂解强度较高的裂解液,例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来,则说明裂解液的强度过强,可以使用较为温和的裂解液如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western,如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想,可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

     

    3、聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理?

     

    答:聚丙烯酰氨凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用的电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。

     

    PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液PH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,PH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有点和效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为PH6.7的Tris-HCl,分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为PH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是PH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种PH值使不连续体系形成了凝胶孔径、PH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

     

    4、怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?

     

    答:影响跑胶跑的质量,有以下几个因素:

    1)  电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55V,分离胶75V就能跑得很好。

    2)  胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶。

     

    5、western blot使用的膜哪种啊,PVDF好还是NC膜,如何选择?

     

    答:PVDF膜可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。NC膜价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。都可以用丽春红染色。

     

    6、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么?

     

    答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢固,不易脱落,结果较好。

     

    7、加甲醇的目的是什么?

     

    答:加甲醇起着一定的固定作用,因为小分子蛋白质容易转出去。(特别是在硝酸纤维素膜上,因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。

     

    8、我想尽量提高转膜的效率(我的实验要求转到膜上的蛋白越多越好,不管是什么大小的蛋白)不知道有哪些办法?

     

    答:不管怎么转都会存在蛋白转移不完全(电压过小、时间过短)或过度转移(电压过大、时间过长)的问题,鱼(小分子量)和熊掌(大分子量蛋白)不可兼得。建议把胶切成两半,比如以35KD为界,分别进行转膜,下半时间短,上半时间长一点,应该会好一些。

     

    9、Western blot中湿转和半干转的方法区别?

     

    答:半干式转膜速度快,而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。

     

    10、半干转是否要求膜,滤纸,胶同样大小?因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?什么是短路?如何控制和发现短路呢?

     

    答:可以相等,但是如果膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层滤纸也不能因过大而相互接触,这样同样会短路,电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的,后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般buffer和滤纸选的对就不会短路。

     

    11、丽春红(Ponceau S)染色的原理及特点?

     

    答:丽春红染色(Ponceau S Staining Solution)可以用于PVDF膜、硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜上的蛋白的检测。丽春红带负电荷,可以与带正电荷的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区结合,从而形成红色的条带。丽春红对蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸馏水,PBS或其它适当溶液洗去。

     

    12、如何更高效的监测转膜效率呢?

     

    答:立春红(也包括考染胶)的灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远,即使立春红染膜无颜色,也无法提示WB结果会不会失败(考染胶无颜色也不能说明转膜充分了,除非你银染),你仍然得继续后面的操作;相反靶蛋白区域有颜色,亦无法提示靶蛋白就转膜完全了,也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。因此,无论立春红染膜失败或成功,你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间,而且增加一轮漂洗的操作,对膜和膜上的蛋白都不好。

     

    除了立春红染色外,你还可以选择预染Marker来监测你的转膜效率。理论上,同时转膜、颜色是交联到蛋白上的,因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上,非常直观、不会增加任何额外的操作(固定marker的上样量非常必要)。

     

    13、抗体孵育缓冲液的选择?

     

    答:某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体,而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体,结果因抗体而异,有时两者结果相同,有时结果不同。如果不存在高背景的问题,某些抗体用含低浓度(0.5 – 0.25%)脱脂奶粉或 BSA的封闭液来稀释,可产生相对更强的信号条带。

     

产品中心 Products
在线咨询
咨询热线

[关闭]