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    膜蛋白的提取方法,

    发布时间: 2020-09-10  点击次数: 394次

    一、膜蛋白简介

    膜蛋白在细胞中扮演着重要的角色:例如被熟知的识别、信号转导、运输等功能,也是用药的理想的靶点,虽动物细胞主要有9种膜脂,而膜蛋白的种类繁多,多数膜蛋白分子数目较少,但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

    根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式,膜蛋白可分为两大类型:外在膜蛋白、内在膜蛋白。

    (1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白,靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合,因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来,膜结构并不被破坏。

    (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密,一般只有用去垢剂(detergent)使其膜解后才可分离出来。

    附注:使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整合膜蛋白。

    二、膜蛋白的提取方法

    谈及蛋白分离,我们想到:超速离心,盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多,不同的蛋白质由于结构和组成的差异,其溶解度也各不相同.根据蛋白质的溶解特性,同时可选择不同的溶剂提取,分为水溶液提取和有机溶剂提取.

    但是与胞质蛋白,核蛋白提取不同之处在于膜蛋白是嵌在膜中的,水溶性不好,基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等,然后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂,一般常用的有胆酸盐,CHAPS(一种离子去污剂),Emulgen和Lubrol等表面活性剂。

    1)先分离膜,然后提取;如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎,然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的粗组分。(例如:用液氮研磨组织,加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂,然后差速离心、蔗糖密度梯度离心。收集37%与41%间的成分,即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白 )

    2)用特殊的去污剂选择性的分离。 从膜上提取蛋白有许多困难。在多数情况下,都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来,然后将蛋白质稳定。去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定,但在某些情况下,还要考虑到以后的纯化步骤。虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化,但终仍可能需要除去去垢剂。这常常会引起蛋白质失活,但如果蛋白质是用于测序的,他将不是一个问题。如果不是用于测序的,可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中,都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而,他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时,必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收,如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关,就应避免使用这类去垢剂.

    将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后,再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白,而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白,无论在种类上还是数量上,都比酸溶解法所得到的蛋白(<5000Da)要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%,所以充分的膜蛋白的提取,无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 酸溶解法简单,可靠,但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4℃时所有的蛋白质原则上都溶于Triton X-114水溶液,在温度超过20℃时,此溶液分为水相和去污相;此时亲水性蛋白溶于水相,疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。

    3 )膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP):CMP分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统,一般有去垢剂(如SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团(P-端),又具有阳离子钙(C-端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现,样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换,从而达到分级分离的目的。

    4) 顺序抽提法:根据细胞蛋白溶解性的差异,用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白;把未溶解的沉淀用标准液溶解提取高疏水性蛋白;后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液,可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

    5)离心蛋白提取法(centrifugal protein extraction)

    原理:高渗的蛋白裂解液让细胞溶胀破裂后,超高速离心

    评价:尽管分级(胞浆和胞膜)之间有清洗的步骤,但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点.该方法相较MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上发表的分级抽提法减去了一步(用tris抽提水溶性蛋白)和后一步(极难溶蛋白),在操作上也作了简化,总而言之是一种不错的方法。

    6)detergent- based:提取时先用裂解液裂解胞膜(选用不同的去污试剂是关键),梯度离心分离细胞器(ER),然后分级抽提方法。例如,去掉细胞器之后的DEBRIS就是核膜,再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。

    总的感受:细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白,方便迅速。

    注意事项:膜蛋白的含量比较少,需要收集大量的细胞,艾美捷推荐用试剂盒提取膜蛋白如:膜蛋白细胞组分提取试剂盒,很短的时内得到高纯度的蛋白并且具有天然活性的多层跨膜蛋白,且能够有效的去除多糖、核酸等杂质。

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