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    石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

    发布时间: 2020-09-15  点击次数: 1275次

    石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

    1、 石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗(冬天脱蜡时间稍微延长)。

    2、 修复:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释)覆盖组织,37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

    3、 破膜:切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育20min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

    4、 加试剂1,2:按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合,加到圈内覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃恒温箱孵育2小时,湿盒内加少量水保持湿度。

    5、 BSA封闭:将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min,在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织,室温封闭30min。

    6、 加一抗:轻轻甩掉封闭液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

    7、 加二抗:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织,避光室温孵育50min。

    8、 DAPI复染细胞核:切片用PBS(PH7.4)洗涤3次,每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。

    9、封片:玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

    10、 镜检拍照:切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm;FITC绿光激发波长465-495nm,发射波长515-555 nm;CY3红光激发波长510-560,发射波长590nm)

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