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    重组细胞因子蛋白溶解详细步骤及注意事项

    发布时间: 2020-09-22  点击次数: 375次

    为了运输方便,稳定活性,一般细胞因子蛋白均为冻干粉,除非一些特殊的重组蛋白。冻干粉可以保证细胞因子在室温条件下很稳定(至少一个月),当然,为了你能得到更加准确的实验结果,确保蛋白的活性,我们建议你在收到产品后应立即保存于-20℃。对于大多数蛋白质,重悬后在4℃仅能短期保存(约一周)。如果想长期保存,请先配制成稀释液(其中必须含有载体蛋白,如0.1% BSA,5%HSA,或10% FBS),然后分装成合适的量并冻存于-20℃或-80℃。一定要避免反复冻融,因每次冻融均会引起蛋白的部分失活。

    我们在进行科学研究时,需要将细胞因子按照一定的浓度,以液体的形式加到培养体系或注射入动物体内,因此,在使用前必须将冻干粉进行溶解。在溶解过程中一定要小心仔细,因为溶解不好会导致细胞因子失活或浓度不准确,进而影响实验结果及研究进度。这也是我们在实际使用中经常遇到的问题。

    那么,怎样的溶解方式才会达到的效果呢?

    步:开盖前一定要离心试剂管。

    我们的细胞因子蛋白冻干粉是装在无菌的塑料管中的。在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁或管盖上,在收到产品时甚至看不到管中有什么东西,所以在打开塑料瓶盖前,一定要将冻干粉进行离心,保证全部产品都在管底,这样用很小体积的液体就可以将冻干粉完全溶解了。

    那么,在离心的时候用多少转速、多长时间离心试剂管,才能达到良好的收集效果呢?

    这个主要看我们实验室离心机配置了。比如我们一般用的台式小型高速离心机,在其面板上一般会有Spin键的。使用此功能,离心机会自动快速的达到大转速(10000rpm或12000rpm),上升到点后速度即刻下降,直至停止旋转,整个过程大约30s。Spin一次就足以将细胞因子蛋白收集到管底。

    当然,如果实验室没有这样的高速离心机,只有转速为4000-4500rpm的离心机,那么只需要将离心机转速设置为3000-3500rpm离心5min,就能达到如上的效果,放心的用于溶解。

    第二步:用无菌水或合适的Buffer重悬至0.1-1.0 mg/ml,不可振荡。

    从这一步开始,正式进入溶解环节,决定着细胞因子的浓度是否正确,活性是否可以达到100%,所以一定要小心操作。

    首先,要选择正确的溶液重悬冻干粉,一般选择说明书推荐的。

    可以用于细胞因子冻干粉溶解的溶液有很多,有的可以直接用无菌水溶解,有的需要不同组分的buffer。如重组人IL-4可以用水溶解,但是重组人IL-2就需要用100 mM醋酸溶解,重组IL-13需要20mM的HCl溶解,重组人TGFB1需要pH3.0浓度为10mM的柠檬酸溶解,重组人FGF-10需要pH7.4浓度为5mM的磷酸钠溶解。

    对于重组细胞因子冻干粉来说,即使是同一个分子的蛋白,不同批次间的溶解方法也可能会有所不同,因此,我们每一个出库的产品都会随产品包装有一份COA资料,将这个产品溶解的具体要求写清楚。当然,在购买之前,也可以通过联系我们,得到关于这个产品的详细信息。

    可能大家看到这里,就有所疑问,为什么一个简单的溶解还需要这么多种方法呢?

    其实这个是由蛋白质的性质决定的。我们知道影响蛋白质溶解性的因素有很多,比较重要的是溶液的pH值和离子强度。在每一个细胞因子重组蛋白在出库之前,都会经过严格完整的QC检验,会对冻干粉的溶解溶液进行测试,将能完全溶解该因子产品的溶液标明。如果您在溶解时所用溶液的pH值和离子强度与说明书中所标明的不符,可能会使细胞因子溶解不完全,甚至完全不溶解,这样就会使这个蛋白的活性不够或丧失。

    当然也有人会根据习惯直接用PBS或培养液等溶解细胞因子的冻干粉,这样做也不是不可以的,因为有部分细胞因子冻干粉的适溶解液就是1XPBS。对于这类的细胞因子用PBS溶解是完全没有问题的,也可以用培养基溶解,不过还是先用PBS溶解,再用培养基溶液进行稀释。对于那些溶解液不是PBS的细胞因子冻干粉,就千万不能用PBS直接溶解了,这样可能会造成不必要的损失。

    其次,一定要按照说明书溶解到的浓度。

    重组细胞因子想要保持良好的稳定性是需要一定的浓度范围的,这个范围在说明书上都会标明,如0.1-1.0 mg/ml。当然,这个浓度对于不同的细胞因子是会有所不同的。如果高于或低于这个浓度范围,就可能会使细胞因子的活性下降。如果高于这个浓度范围,就有可能会超过该因子的大溶解度,使其无法完全溶解。还有就是高于或低于这个范围,可能会出现蛋白质聚集现象,同样会使部分蛋白质不溶解,导致蛋白质活性下降。

    第三,在溶解过程中不可以振荡(vortex)。

    在固体溶解的时候,为了使其溶解充分,我们一般会用涡旋仪进行快速振荡。但是对于细胞因子重组蛋白来说,只有具有一定的空间结构才可能使其活性。因此,在冻干粉溶解过程中,一定不能用涡旋振荡器进行vortex。

    那么为了保证冻干粉充分溶解,我们该怎么办呢?其实这个操作很简单,也是我们在生物学实验中经常用到的方法,就是用移液器的*头轻轻的吹打几次,就可以做到细胞因子完全溶解,因为大多数的蛋白都是容易溶解于合适的溶液的。有些不易溶解的蛋白,一般会在说明书中进行备注,如缓慢溶解或溶解缓慢等。这类的细胞因子,可以将其放置于水平摇床上低速摇一段时间,促使细胞因子蛋白完全溶解。有些细胞因子也可能需要将重悬液在4℃静置2h以上。

    第三步,直接溶解的细胞因子液体在2-8℃长可保存1周。

    将细胞因子按照说明书上推荐的溶液稀释好后,可以放置在2-8℃,即冰箱的冷藏室。这样在一周之内,细胞因子的活性是比较稳定的。这种保存方式可以用于那些实验周期为5-7天的研究,如树突状细胞的诱导成熟实验。在这个过程中,只需要每次从冰箱吸取一定量的细胞因子溶液加入到培养体系中即可。

    第四步,如果想长期保存或稀释,则需用含载体蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液进一步稀释,然后分装冻存于-20℃至-80℃。

    在实验过程中,我们用到的试剂浓度一般是比说明书上的浓度低的,需要我们进行稀释,一般选择的稀释液为含载体蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液,这样就可以防止稀释后的细胞因子粘附在管壁或瓶壁上,不会影响溶液中的细胞因子的浓度及活性。

    如果一个实验的周期比较长(大于1周),或配制的细胞因子溶液一次用不完,就需要我们将其进行长期保存。具体操作为:用含载体蛋白(如0.1% BSA,或10% FBS,或5% HSA)的溶液对细胞因子溶液进行稀释,然后按照一次实验的基本用量分装到合适大小的EP管中,然后冻存于-20℃至-80℃。

    那么,如果直接将用说明书推荐的溶液溶解的细胞因子直接或分装后存于-20℃至-80℃,是不是可以呢?其实,这样操作是不科学的,我们做过ELISA实验的同学都知道。ELISA的包被抗体会通过粘附作用包被到酶标板上,这是因为抗体可以很好的吸附到塑料板上,粘附后,抗体就很难与板分离。同样的道理,细胞因子与抗体一样都属于蛋白质,他们具有容易吸附到塑料制品上的特性。因此,直接冻存就会使细胞因子粘附在管壁上,并且难以分离,会使其浓度及活性下降。而添加载体蛋白就是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点,使细胞因子不再粘附与管壁。

    含有载体蛋白的溶液一般pH近中性,有一定缓冲能力的缓冲液,如PBS或培养基,不可以为水溶液。然而,在做无血清培养或动物的体内实验时,要求细胞因子中不能含有BSA,FBS或HSA等动物或人的蛋白,那要长期保存细胞因子蛋白该怎么办呢?其实这很容易解决,可以订购小包装的细胞因子,每一次使用5-7天后就丢弃。只是需要您每次多买几只,在用之前再去稀释冻干粉,用不到的先将冻干粉保存于-20℃至-80℃。

    当然,在我们的细胞因子冻干粉中会添加海藻糖。海藻糖可以起到载体蛋白相同的作用,防止细胞因子粘附到塑料管壁上这样既可以直接长期保存,也可以用推荐的溶液来稀释分装后长期包装。无动物源成分的细胞因子就可以用于无血清培养或动物体内实验了。

    总之,为了保证细胞因子冻干粉在溶解后还能保证100%的活性和准确的浓度,在溶解过程中一定要严格按照说明书中的方法操作。

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