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    ELISA实验操作常见问题及解决方法总结

    发布时间: 2020-10-16  点击次数: 379次

    ELISA即酶联免疫吸附实验,是目前广泛应用于各种抗原抗体检测的方法,主要有灵敏度高和特异性强的特点。ELISA操作步骤看似简单,整个测定过程中却有诸多影响因素,导致检测结果可能与实际结果偏差较大。为帮助大家分析实验中常见问题,我们将常见问题的可能原因和解决方法归纳总结于下表:

     

    问题一:高背景或阴性对照值偏高

    能原因

    建议

    阴性对照孔被阳性对照或样品污染

    洗涤时,勿将洗液溢出孔外

    抗体非特异性结合 

    封闭液不适合,更换封闭液

    酶结合物过浓

    请检查酶结合物是否按说明书规定稀释

    孵育温度过高

    检查孵育箱的温度是否正确、稳定

    底物在使用前曝光

    应保存在暗处,避光

    读板前停留时间过长

    加终止液后3分钟内读数

     

     

    问题二:阳性对照值偏低或低吸光度

     

    能原因

    建议

    试剂未平衡至室温

    实验开始前,将试剂盒从冰箱取出平衡至室温

    检测体积偏小

    检查移液器吸液管道是否堵塞

    孵育时间过短 

    使用计时器,准确孵育时间 

    底物受污染 

    使用新配置的试剂,重新实验

    包装袋中有湿气 

    检查袋中是否有干燥剂 

    样本中有抑制剂

    叠氮钠会抑制HRP酶的活性 

     

     

    问题三:边缘效应

     

    能原因

    建议

    蒸发 

    各步之间,须使用封版胶密封反应板

    温度不均匀 

    校准孵育箱,勿叠放反应板

     

     

    问题四:标准曲线不佳 

     

    可能原因

    建议

    倍比稀释标准品时未混匀 

    稀释标准品的每一步均需混匀

    过早稀释

    标准品在快要使用时稀释

    加入的体积不正确

    使用校准过的移液器,快速、等量的将标准品分配到各个微孔中

     

     

    问题五:标准曲标准曲线良好,但样本无检测信号

     

    可能原因

    建议

    样本中无检测物或检测物含量极低

    设置内参,重新实验

    样本中其他物质影响/掩盖检测

    作适当稀释,降低其他物质的干扰,或作系列稀释,检测回收率

    样本中检测物浓度过高,Hook效应导致假低值

    适当倍数稀释样本,检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内

     

     

    问题六:重复性较差

     

    可能原因

    建议

    微孔中有气泡

    用针尖挑破气泡

    试剂未混匀

    确保充分混匀试剂

    样本中有杂质或沉淀物

    使用前离心

    微孔包被面被吸头划破

    加液时小心操作

    使用用过的封板胶纸

    每次须使用新的封板胶封住反应孔

     

     

    问题七:假阳性反应

     

    可能原因

    建议

    洗涤不充分 

    使用前需检查洗板机是否正常工作

    洗板机管道堵塞

    需经常维护洗板机 

    加结合物时,洒在微孔边缘 

    小心向微孔加入结合物,加入微孔底部中央,避免与孔壁和边缘接触 

    检测样本中含有红细胞 

    离心 

    微孔中液体挥发 

    用封板胶密封反应孔,置于湿盒内 

     

     

     

    问题八:整块板产生阳性OD值或整个板显蓝色

     

    可能原因

    建议

    洗涤液体积不足或底物被残留于孔底的结合物所污染 

    洗涤时,缓冲液充满至孔边缘,但要确保不能溢出孔外

    结合物浓度过高

    检查是否按照说明书推荐比例稀释 

    血清中有血清因子 

    勿加热血清 

    底物容器不洁净 

    用酸清洗容器瓶,用蒸馏水冲洗

    底物孵育时,微孔板曝光 

    加底物时,立即将板置于暗处

     

     

    问题九:整块板OD值偏低

     

    可能原因

    建议

    显色时间不足 

    适当延长显色时间 

    孵育温度偏低 

    36度为适反应温度(欣博盛ELISA试剂盒) 

    未加终止液 

    加入终止液,增强颜色反应的强度,稳定终的颜色反应 

     

     

    问题十:显色缓慢

     

    可能原因

    建议

    样本未置于室温 

    实验开始前,将样本平衡至室温 

    酶结合物活性减弱 

    检测稀释度 

    酶活性收到抑制如叠氮钠 

    避免实验不当的防腐剂 

    显色温度不适当 

    按说明书操作

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