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全基因敲除

全基因敲除

更新时间:2021-05-13

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厂商性质:经销商

简要描述:
构建Cas9/sgRNA过表达质粒和含Donor片段的过表达质粒,转染Thp-1细胞,再通过流式分选对GFP和mCherry阳性的细胞进行筛选,挑单克隆经鉴定后进行扩增,得到MIR3945HG全基因敲除的单克隆细胞株。
品牌其他品牌产地类别进口
应用领域生物产业,制药

 

技术简介

 

根据基因的结构特征,选择整个基因,基因组序列作为敲除区域,在基因的5'和3’UTR区域设计相应的sgRNA,同时构建含与敲除基因5'和3’临近区域同源的Donor质粒,将Cas9,两条对应的sgRNA和Donor共转染目的细胞,通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因靶位点进行切割,引起DNA双链断裂(Double-strand  breaks,DSB),通过细胞自身的同源重组修复(Homology-directed  repair,HDR)途径,将Donor质粒重组到目的细胞的基因组中,造成目的基因在基因组序列上的全基因敲除,达到基因的完全敲除的效果

 

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应用范围

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基因敲除更彻底,用于基因功能研究,抗体验证等实验时更有说服力 适用于存在多个转录本的编码基因的敲除 适用于非编码基因的敲除

 

方案选择

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拥有质粒瞬转和慢病毒感染两种递送方式,可实现大多数细胞系和干细胞的基因编辑 拥有多种荧光筛选标记,结合流式分选,可提高获得阳性目的细胞的概率 在细胞不产生耐药的情况下,可提供多种药筛标签,满足不同实验需求。

 

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应用案例

 

细胞名称:Thp-1

 

基因名称:MIR3945HG

 

项目方案:构建Cas9/sgRNA过表达质粒和含Donor片段的过表达质粒,转染Thp-1细胞,再通过流式分选对GFP和mCherry阳性的细胞进行筛选,挑单克隆经鉴定后进行扩增,得到MIR3945HG全基因敲除的单克隆细胞株。

 

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阳性细胞鉴定:通过对流式分筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定,MIR3945HG基因整个转录本缺失,MIR3945HG基因在功能上到达完全敲除的效果。

 

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项目流程与周期

 

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交付标准

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按方案构建的目的基因编辑细胞株,每个目的细胞株交付基因型正确的2个克隆,每个克隆2支冻存细胞(1×10⑹cells/支) 对照细胞株,瞬转方案为对应野生型细胞,慢病毒方案为Cas9稳转细胞 项目报告及质检报告

 

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