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定点突变细胞定制CRISPR/CAS9

定点突变细胞定制CRISPR/CAS9

更新时间:2020-08-19

访问量:163

厂商性质:经销商

简要描述:
点突变是指基因序列中单个核苷酸碱基的改变。突变发生的位置对基因功能的影响大小不一。对非编码基因而言,大多数点突变没有什么影响;当突变位点位于基因启动子序列中时,则可能影响基因的表达;当发生在内含子剪接位点时,则可能会干扰RNA的正确剪接;当发生读码框内时,可能仅仅引起一个氨基酸的改变而改变整个蛋白的结构和功能。
品牌其他品牌供货周期现货
应用领域生物产业,制药

       点突变是指基因序列中单个核苷酸碱基的改变。突变发生的位置对基因功能的影响大小不一。对非编码基因而言,大多数点突变没有什么影响;当突变位点位于基因启动子序列中时,则可能影响基因的表达;当发生在内含子剪接位点时,则可能会干扰RNA的正确剪接;当发生读码框内时,可能仅仅引起一个氨基酸的改变而改变整个蛋白的结构和功能。

        从进化论的角度看,点突变既可能是有益的也可能是有害的。有益的突变使个体产生优势,并将该特性传给后代,从而使整个种群得到改善;有害突变会导致个体死亡,或通过自然选择的方式使其繁殖能力大大降低从而被淘汰。而大多数情况下我们更关注因点突变引起的疾病,如遗传性疾病镰刀性贫血症以及各种肿瘤。

      通过构建点突变细胞株,可以进行单核苷酸多态性、遗传性疾病、肿瘤等的研究,也能用于靶向药、基因疗法的开发。基于大量项目的经验,睿远能够提供同源重组、单碱基编辑、先导编辑等多种技术,能够实现几乎所有位点基因突变细胞株的构建。

技术简介

同源重组技术

      利用CRISPR/cas9技术,设计并构建cas9/sgRNA和含目的基因点突变的供体载体(Donor),将CAS9/sgRNA和Donor质粒共转染目的细胞,通过sgRNA引导Cas9核酸酶对目的基因位点进行切割,引起DNA双链断裂(Double  strand  breaks    DSB),细胞以Donor作为模板进行同源重组修复(HDR),将目标点突变重组到基因组靶位点,从而获得目的基因点突变的细胞系。

 

定点突变细胞(图1)

Base  editing  技术

        单碱基编辑技术是一种基于核酸酶失活的CAS9(dcas9)或cas9切口酶(cas9n)、胞嘧啶脱氨酶(APOBEC1)或腺嘌呤脱氨酶(TadA)以及sgRNA形成的复合体,在不断裂DNA双链的情况下,利用sgRNA将复合体靶向与sgRNA互补配对的基因组靶位点,对靶向位点进行编辑,实现在活性窗口内C-T、G-A、A-G,T-C的单碱基转换

定点突变细胞(图2)

Prime   editing技术

 

    Prime  editing(PE)系统是在原有的CRISPR/CAS9体系基础上进行改造开发出来的基因编辑系统,该系统包括2个元件:pegRNA(prime  editing  guide  RNA)和nCas9(H840A)-M-MLV逆转录酶的融合蛋白。psgRNA是一段改造后的sgRNA,它在传统sgRNA的3‘末端增加了一段RNA序列。pegRNA由3个部分组成,包括Single-guide  RNA(sgRNA)、引物结合位点(Prime  Binding  site)PBS和储存有靶向位点编辑信息的逆转录模板(RT-template)。在pegRNA的引导下,融合蛋白会靶向sgRNA互补配对的基因组靶位点,并对含PAM的靶DNA链进行切割(pegRNA的非互补链)。随后,PBS序列与被切割的目标DNA链互补配对,逆转录产物(DNA)包含我们所需要的突变位点。这段逆转录DNA会入侵并进入基因组DNA发生整合,细胞利用体内修复机制对整合DNA切口进行修复,使所需要的突变位点整合到基因组靶位点,从而获得目的基因点突变的细胞系。

 

定点突变细胞(图3)

应用范围

123
可用于单基因多态性及单碱基突变引起的疾病的研究可用于靶向药、基因疗法等的开发可通过引入终止密码子实现基因敲除,尤其是当目的基因存在重合基因时

方案选择

123
同源重组只能选择瞬转方案,单碱基编辑和先导编辑可选择瞬转或者慢病毒方案拥有多种荧光筛选标记,结合流式分选,可提高获得阳性目的细胞的概率在细胞不产生耐药的情况下,可提供多种药筛标签,满足不同实验需求

定点突变细胞(图4)

应用案例

细胞名称:Hep  G2

基因名称:CYP3A5

项目方案:根据CYP3A5基因突变位点序列设计sgRNA,利用CRISPR/CAS9对目的位点进行切割,引起DNA双链断裂,通过同源重组的方式将含有突变位点rs776746(A>G)的目的片段引入位点,通过GFP标签筛选出CYP3A5的单克隆细胞。

定点突变细胞(图5)

    阳性细胞鉴定:通过对流式分选筛选出的单克隆细胞进行PCR及测序鉴定,CYP3A5基因rs776746位点A成功突变为G

定点突变细胞(图6)

 

项目流程与周期

定点突变细胞(图7)

交付标准

123
按方案构建的目的基因编辑细胞株,每个目的细胞株交付基因型正确的2个克隆,每个克隆2支冻存细胞对照细胞株,瞬转方案为对应野生型细胞,慢病毒方案为CAS9稳转细胞项目报告及质检报告

 

 

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